化妝品中補骨脂特征成分補骨脂素、異補骨脂素、新補骨脂異黃酮和補骨脂二氫黃酮的檢測方法
1 適用范圍
本方法規(guī)定了用高效液相色譜法定性檢測化妝品中補骨脂特征成分補骨脂素、異補骨脂素、新補骨脂異黃酮和補骨脂二氫黃酮的方法。
本方法適用于化妝品中補骨脂特征成分補骨脂素、異補骨脂素、新補骨脂異黃酮和補骨脂二氫黃酮的定性測定。
2 方法提要
樣品在經(jīng)過提取后，經(jīng)高效液相色譜儀分離，二極管陣列檢測器檢測，經(jīng)與平行操作的補骨脂素、異補骨脂素、新補骨脂異黃酮和補骨脂二氫黃酮對照品及補骨脂對照藥材比較，以保留時間和紫外光譜圖定性，鑒別補骨脂特征成分補骨脂素、異補骨脂素、新補骨脂異黃酮和補骨脂二氫黃酮的存在。本方法對補骨脂素、異補骨脂素、新補骨脂異黃酮和補骨脂二氫黃酮的檢出限和取樣品0.5 g時的檢出濃度見表1。
表1 4種補骨脂特征成分的檢出限和檢出濃度
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化合物
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檢出限（ng）
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檢出濃度（μg/g）
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補骨脂素
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0.3
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0.6
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異補骨脂素
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0.3
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0.6
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新補骨脂異黃酮
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0.3
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0.6
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補骨脂二氫黃酮
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0.3
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0.6
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3 試劑和材料
除另有規(guī)定外，所用試劑均為分析純，水為實驗室用一級水。
3.1 乙腈，色譜純。
3.2 補骨脂素，純度≥99%。
3.3 異補骨脂素，純度≥99%。
3.4 新補骨脂異黃酮，純度≥98%。
3.5 補骨脂二氫黃酮，純度≥99%。
3.6 補骨脂，中國食品藥品檢定研究院，供鑒別用。
3.7 補骨脂特征性成分混合標準溶液（=0.1 μg/mL）：分別稱取補骨脂素（3.2）、異補骨脂素（3.3）、新補骨脂異黃酮（3.4）、補骨脂二氫黃酮（3.5）對照品各5 mg（精確到0.1 mg），置500 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，配制成質(zhì)量濃度各為10 μg/mL的標準溶液。精密量取各標準溶液0.1 mL置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得0.1 μg/mL的混合標準溶液。
3.8 補骨脂標準儲備溶液：取補骨脂對照藥材0.2 g，置50 mL三角瓶中，加30 mL 70%乙醇回流提取1h，濾過，濾液置100 mL量瓶中，加70%乙醇稀釋至刻度，搖勻，即得。
4 儀器
4.1 高效液相色譜儀：具二極管陣列檢測器。
4.2 分析天平：感量為0.1 mg。
4.3 移液器。
4.4 渦旋振蕩器。
4.5 超聲波清洗儀（功率不低于200W）。
4.6 高速離心機：轉(zhuǎn)速不小于10000 r/min。
5 測定步驟
5.1 樣品預(yù)處理
膏、霜、乳類：稱取0.5 g（精確至0.1 mg）樣品，置10 mL量瓶中，加6 mL甲醇，渦旋振蕩使試樣與提取溶劑充分混勻，超聲提取20 min，放至室溫，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，轉(zhuǎn)移至10 mL具塞塑料離心管中，以12000 r/min離心5 min，上清液經(jīng)0.45 μm濾膜過濾，濾液作為待測溶液備用。
液體類：稱取0.5 g（精確至0.1 mg）樣品，置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，混勻，必要時，轉(zhuǎn)移至10 mL具塞塑料離心管中，以12000 r/min離心5 min，上清液經(jīng)0.45 μm濾膜過濾，濾液作為待測溶液備用。
固體粉類：稱取0.5 g（精確至0.1 mg）樣品，置10 mL量瓶中，加8 mL甲醇，混勻，超聲提取20 min，放至室溫，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，靜置，必要時，轉(zhuǎn)移至10 mL具塞塑料離心管中，以12000 r/min離心5 min，上清液經(jīng)0.45 μm濾膜過濾，濾液作為待測溶液備用。
5.2 高效液相色譜參考條件
色譜柱：C18柱（100 mm×4.6 mm，3 μm，以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑）或具有同等柱效的色譜柱；
流動相：乙腈＋0.1%醋酸水溶液，梯度洗脫，洗脫程序見表1。
注：梯度洗脫條件，操作者可根據(jù)樣品的不同選擇最佳條件，使4種成分與其他組分峰獲得完全分離。
流速：1.0 mL/min。
檢測波長：246 nm。
柱溫：30℃。
進樣量：10 ?0?8L。
5.3 樣品測定
按設(shè)定的色譜條件（5.2），取補骨脂特征性成分混合標準溶液（3.7）進樣，進行高效液相色譜分析，記錄各色譜峰相應(yīng)的保留時間和紫外光譜圖；取補骨脂標準儲備溶液（3.8）進行高效液相色譜分析，記錄各色譜峰相應(yīng)的保留時間和紫外光譜圖。取待測溶液（5.1）進樣10 μL分析，若樣品色譜圖中，在與補骨脂特征性成分--補骨脂素、異補骨脂素、新補骨脂異黃酮和補骨脂二氫黃酮對照品相應(yīng)保留時間處有相同色譜峰出現(xiàn)，且具有相同的紫外光譜，則可以定性鑒別補骨脂特征性成分補骨脂素、異補骨脂素、新補骨脂異黃酮和補骨脂二氫黃酮的存在。
5.4 平行試驗
按以上步驟操作，對同一樣品獨立進行測定，獲得的兩次獨立測試的色譜峰保留時間不得超過±1 min。
5.5 陽性結(jié)果確證
測定過程中若補骨脂素和異補骨脂素檢出陽性結(jié)果，而新補骨脂異黃酮和補骨脂二氫黃酮低于檢出限，可適當富集樣品對新補骨脂異黃酮和補骨脂二氫黃酮的檢測進一步確證。
6 精密度、穩(wěn)定性和重復(fù)性
高、低兩個濃度水平的補骨脂標準儲備溶液的精密度、穩(wěn)定性和重復(fù)性，在不同空白基質(zhì)中，補骨脂素和異補骨脂素、新補骨脂異黃酮和補骨脂二氫黃酮4種特征性成分的保留時間和峰面積的RSD均小于5%（n=6）。
7 色譜圖
圖1 4種補骨脂特征成分混合標準溶液（10 μg/ mL）HPLC色譜圖
圖2 補骨脂標準溶液（2 mg/mL）HPLC色譜圖
色譜峰：1. 補骨脂素，2. 異補骨脂素，3. 新補骨脂異黃酮，4. 補骨脂二氫黃酮
